成本較高：一步法免染 SDS-PAGE 凝膠快速制備試劑盒由于包含預混試劑、特殊免染染料等，研發和生產成本較高，導致市場售價相對昂貴。對于一些預算有限的實驗室或大規模常規實驗，使用該試劑盒會大幅增加實驗成本。而傳統方法中，科研人員可自行采購基礎試劑進行凝膠配制，在原材料成本控制上更具靈活性，長期使用下成本更低。

部分實驗適用性受限：免染技術雖然方便快捷，但在某些特定實驗中存在局限性。例如，對于低豐度蛋白質的檢測，傳統染色方法如銀染具有更高的靈敏度，能夠檢測到含量極少的蛋白質。而一步法免染試劑盒中的染料，在檢測低豐度蛋白質時，可能因信號較弱而無法準確呈現，導致漏檢。此外，若實驗需要對蛋白質進行后續的質譜分析，傳統染色方法（如考馬斯亮藍染色）在脫色后對蛋白質的影響較小，不干擾質譜鑒定；但免染試劑盒中的染料可能會與蛋白質緊密結合，影響質譜分析的準確性和靈敏度。

缺乏實驗靈活性：傳統 SDS-PAGE 凝膠制備方法允許科研人員根據具體實驗需求，靈活調整凝膠濃度、緩沖液配方等參數。例如，針對不同分子量范圍的蛋白質樣品，可精確配制合適濃度的凝膠，以達到最佳分離效果；在緩沖液中添加特定成分，還能研究蛋白質在特殊環境下的分離特性。而一步法免染試劑盒的預混配方相對固定，雖然能滿足大部分常規實驗，但在應對一些特殊實驗需求時，無法像傳統方法那樣自由調整，限制了實驗的靈活性和創新性。

染料兼容性問題：一步法免染 SDS-PAGE 凝膠快速制備試劑盒中的免染染料與部分后續蛋白質分析技術的兼容性可能存在問題。例如，當實驗后續需要使用特定熒光標記抗體進行蛋白質檢測時，免染染料的熒光特性可能會與標記抗體的熒光產生干擾，影響熒光信號的檢測和分析。相比之下，傳統方法在染色步驟中，可根據后續實驗選擇合適的染色方式，有效避免此類兼容性問題。

保質期與儲存要求嚴格：該試劑盒中的部分成分，尤其是免染染料和聚合相關試劑，對儲存條件要求較為嚴格，通常需要低溫保存，且保質期相對較短。若儲存不當或超過保質期，可能會導致凝膠聚合異常、染料失效等問題，影響實驗結果。而傳統方法中使用的基礎試劑，如聚丙烯酰胺、Tris 等，在正確儲存條件下保質期較長，對儲存環境的要求相對寬松，更便于管理和使用。